抗體效價
我們常說的抗體效價（antibody titer）也能夠被稱為抗體滴度，是特異性抗體生物活性的重要標(biāo)志，反應(yīng)了特異性抗體與抗原的結(jié)合能力?？贵w效價是疾病診斷、特異性免疫球蛋白制備和疫苗評價等領(lǐng)域的重要指標(biāo)，對其檢測在臨床上意義重大。
從細(xì)胞化學(xué)角度說，抗體效價指的是抗體在保持其最佳特異性染色，并且具備最小背景染色條件下的最高稀釋倍數(shù)（通俗一點(diǎn)講就是抗體識別特定抗原決定部位所需要的最低濃度）。
抗體效價的表示
抗體效價通常用“1：X”的形式表示（X表示抗體可以被檢測出來的最大稀釋倍數(shù)），例如抗體效價為1:32,000，就表示抗體被稀釋到32,000倍仍可以檢測出來，再稀釋就檢測不出來了。“：”后面的數(shù)值越大，抗體效價越大，表示抗體與抗原結(jié)合能力越強(qiáng)。
抗體效價測定
抗體效價通常通過ELISA方法來檢測，其實(shí)驗(yàn)原理為將血清樣品先稀釋一定倍數(shù)后，在酶標(biāo)板中逐孔倍比稀釋加樣，采用常規(guī)ELISA方法檢測，讀取OD值。OD值高于空白對照2倍的孔判斷為陽性，顏色最淡的一孔陽性孔的稀釋倍數(shù)即為該血清樣品中目的抗體效價比。
目前常用的幾種ELISA 方法有：間接法，雙抗體夾心法和競爭法等。本實(shí)驗(yàn)采用間接法測定單克隆抗體效價。
間接ELISA
實(shí)驗(yàn)步驟
- 包被特異性抗原：固體抗原用包被液稀釋至100μg/ml，于96孔板每凹孔加100μl，加蓋置4℃過夜。次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加滿稀釋/洗滌液3次，首次洗滌靜止2min后傾去，后兩次靜置1min。將反應(yīng)板扣在濾紙上，以除凈液體。
- 封閉：每孔中加滿封閉液（約300μl多），加蓋或用封口膜封板，置37℃恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。
- 加待測抗體、空白對照（PBS/Tween）：將待測抗體按倍比法用稀釋液稀釋（1:100,1：200,1:400等），取不同稀釋度的待測抗體及空白對照各100μl加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置37℃恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3次。
- 加酶標(biāo)抗體：加入HRP標(biāo)記二抗，每孔加100μl，封板后置37℃溫育1h，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。
- 顯色：首先按每10mlOPD加入15mlH2O2處理。每孔加入OPD應(yīng)用液100μl、反應(yīng)板置室溫暗處5~30min。當(dāng)明顯顯示黃色時及時終止反應(yīng)。
- 終止反應(yīng)：每孔加入100μl 2mol/l H2SO4。由黃色變?yōu)槌壬７€(wěn)定3~5min即可比色測定。
- 檢測：用酶聯(lián)免疫測定儀，測波長為490nm時各孔的光吸收
- 計(jì)算：計(jì)算待檢抗體與空白對照習(xí)慣度比（Positive/negative，P/N），當(dāng)P/N大于2時為陽性，P/N小于2為陰性，取稀釋倍數(shù)最大的陽性結(jié)果為測得的抗體效價。
注意事項(xiàng)
- 聚苯乙烯微量反應(yīng)板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度一般在1~1ug之間，在偏堿性條件下易吸附于反應(yīng)板的凹孔中。
- 反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以出去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時間，切忌相互污染。
- 為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置室溫暗處的時間應(yīng)一致，終反應(yīng)3~5min后應(yīng)立即比色。必要時可設(shè)陽性對照，以固定顯色及終止時間。
相關(guān)產(chǎn)品
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